【成果内容】

乙酰胆碱酯酶(AChE)为膜结合蛋白，定位于细胞膜和突触前后膜，能快速水解神经递质乙酰胆碱(ACh)从而终止ACh对胆碱能受体的兴奋作用，保持神经冲动传导的灵敏性。乙酰胆碱酯酶是生物体内反应最快的酶之一，降解一个分子约80微秒。由于在周围神经中，运动神经束和感觉神经束乙酰胆碱酯酶的含量相差数十倍，比较手术断端神经束的乙酰胆碱酯酶含量差异能够在临床上快速、准确地分辨感觉神经和运动神经。 基于抗原抗体反应的免疫胶体金试纸条技术，具有特异性强、反应时间短（3-5分钟）、无需特殊设备（结果肉眼可见）等优点，十分适于临床手术过程中，快速检测神经束运动支和感觉支。 1）获取基因重组乙酰胆碱酯酶（AChE）抗体 由于人红细胞膜表面存在乙酰胆碱酯酶，为避免手术标本中的血液污染，我们利用基因重组技术，特异性表达神经组织中的乙酰胆碱酯酶蛋白，作为抗原，以期获得制备高亲和性的特异性抗体。人工合成人含第四和第六外显子的乙酰胆碱cDNA（人红细胞膜上的乙酰胆碱酯酶是第五外显子编码），亚克隆至真核表达载体中并转染至293T细胞内，筛选出稳定的重组hAChE表达细胞株。 小鼠免疫：挑选雌性小鼠，将真核表达的hAChE和佐剂混合作为免疫原进行免疫。 融合：加强免疫后分别进行阳性血的采集，进行ELISA检测效价，根据ELISA测定的稀释小鼠血清，取出脾脏研磨后，按常规方法进行融合，筛选的阳性孔进行多次亚克隆，直至100%阳性，即得到单克隆抗体。 2）用于胶体金试纸条的抗体筛选 获取人体脊髓前根和后根标本，制备冰冻切片，用免疫荧光技术筛选能和脊髓前根结合的高效价，强特异性的单克隆细胞株。用于胶体金试纸条制备。 3）胶体金试纸条的制备 将获取的单克隆抗体分别进行HRP标记，进行两两组合配对检测，确定可夹心检测标准乙酰胆碱酯酶的抗体对作为配对抗体，即得胶体金标记的抗乙酰胆碱酯酶单克隆抗体。使用单抗夹心法胶体金试纸条，并检测了重组表达的乙酰胆碱脂酶。 产品技术特征： ①结果准确：试剂和样本用量极小，样本量可低至10-20μl，可增加洗脱液中乙酰胆碱酯酶的浓度，不易出现假阴性；②检测速度快，一般5-10分钟可出结果；③灵敏度高，可达到ELISA的水平，敏感性能够满足临床检测的应用需求；④使用简便，成本低，无需贵重仪器，对专业技能要求不高，室温干燥保存即可。

【潜在应用价值】

本产品获鼓楼区人民政府高层次创业人才引进计划，成立南京费希医药科技有限公司，目前公司处于落地孵化状态，已获得乙酰胆碱酯酶胶体金试纸条产品小样。该产品主要用于周围神经损伤手术中神经性质的鉴别。当周围神经丛、神经干或其分支受外力作用而发生损伤，需要借助本产品对神经功能束进行快速鉴别。根据《中国卫生统计年鉴》的数据，2016年全国县级以上医院中损伤住院总人数为327.01万。这意味着，至少会有327万台手术需要解决周围神经损伤问题。按照每台手术需要20根本项目产品、每根售价100元来测算，国内年度市场需求在65亿元以上。 世界卫生组织对全球66个成员国的外科手术数据进行了统计和测算。2012年外科手术总量为3.13亿，2017年为3.94亿，年均增长率为4.73%。按照保守比例估算，神经损伤在外科手术中占10%计，仍有3940万台临床手术。按照每台手术需要使用价值2000元本项目产品计，国际市场的需求将超过788亿元。 本产品的应用无需取得其他成果或知识产权的授权。

【相关专利号】

实用新型专利ZL201710641207.0